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外泌体疗法—治疗脱发的“新救星”
“请赐予三千烦恼丝，让我不再烦恼”
“头发的日渐稀疏，好像生命的倒计时”
随着社会的节奏加快，人们承受的心里压力日益加重，人群中脱发的发病率也呈越来越高的趋势。据卫健委发布的脱发人群调查显示，我国脱发的人群已超过2.5亿，年龄主要集中在20岁到40岁。
一般情况下，正常人平均每天脱发约40－100根，属于正常新陈代谢，每天脱落的头发和新生发的数量大致相同，因此头发不会变稀。若每天脱发约大于100根，且头发出现生长缓慢，发量明显减少，头发逐渐稀疏的现象，则考虑是病理性脱发。
目前治疗脱发的药物有很多，但是FDA批准的生发药品仅有非那雄胺（Finasteride，1992）和米诺地尔（Minoxidil，1996），这两种药物虽然对脱发有不错的治疗效果，但长期使用对人体有较强的副作用，因此，针对脱发的产品开发一直是热门领域。
近日，北卡大学教堂山分校联合生物医学工程系程柯教授团队在Science Advances上发表文章，针对毛囊乳头细胞促进毛囊生长的作用机制进行研究，最后证明了毛囊乳头细胞（DP）外泌体中miRNA-218-5p在促进毛囊生长中的作用。
在毛囊的休止期，毛囊干细胞位于毛囊的凸起区域。在基质细胞凋亡过程中，毛囊乳头细胞（DP）发生聚集并向上迁移，当达到凸起时，释放刺激毛囊干细胞分化并触发毛囊再生的信号。因此，毛囊乳头细胞（DP）可以控制着毛发的生长周期，毛发的粗细，可诱导毛囊生长。
研究人员将DP细胞分别用三维培养（3D）和平面培养（2D）并观察其形态（图1 A/B/C），进一步研究发现3D培养的DP细胞比2D培养更好地促进毛囊中的β-catenin和CD133的表达（图1D）。这两种蛋白的表达与毛囊干细胞的功能以及毛囊的再生有关。所以，3D培养可能更有助于DP细胞发挥生发作用。研究者还发现使用角蛋白水凝胶做DP细胞移植的载体，可以提高的细胞存活率（图1 G/H/I）。
图1. 毛囊乳头细胞2D和3D培养对比
为了验证DP细胞3D培养的优势，作者进行了动物实验，将脱毛后的小鼠的一侧注射2D培养DP细胞、3D培养DP细胞和5%米诺地尔，10天后，从两个注射部位提取背部皮肤样本，皮肤样本(左)和未处理部位(右)。对毛囊细胞的β-catenin、CD133和Ki67进行染色染色，比较不同培养条件下的DP细胞和5%米诺地尔的生发机制及潜力。
图2表明，经过米诺地尔处理的部位没有β-catenin和CD133的表达，但Ki67信号是有了明显的增加，说明米诺地尔的生发机制不是直接调节DP细胞，而是促进周围的血管生成。该研究也展示了，植入DP细胞不仅影响注射部位的毛囊，也能够调节未注射部位的毛囊，而且3D培养DP细胞的移植对毛囊生长有更好的调节作用。
因此，研究者在这里有个猜想，由于DP细胞在皮肤中的迁移非常有限，所以旁分泌效应可能是这一过程中的一个重要机制。
图2.比较毛囊期与局部治疗5%米诺地尔注射2D DP细胞或3D球体
研究人员又做了小鼠背毛生长实验（图3A），研究者分别对小鼠无毛背部一侧注射PBS、5%米诺地尔、角蛋白水凝胶，3D培养DP细胞及角蛋白水凝胶为载体的3D培养DP细胞（3D DPs/keratin），在注射后的第0、10、15和20天，研究者拍摄了脱毛小鼠毛发再生的状态。在注射后第10天，米诺地尔和细胞处理组开始出现黑色色素沉着。3D DPs/keratin组的所有小鼠的皮肤都比其他组的皮肤颜色深。在第15天，米诺地尔组处理的一侧显示了35%的皮毛覆盖，相比之下，未处理的一侧只有10%。3D培养DP细胞组的皮毛覆盖度平均为40%，而3D DPs/keratin组的皮毛覆盖度约为90%。可以看出，3D DPs/keratin组可以明显促进小鼠背部毛发的生长，而且与米诺地尔组相比，细胞治疗更能促进未注射一侧毛发的生长，证明了细胞生发可能由旁分泌主导的猜想。此外，角蛋白水凝胶显著增强了DP细胞移植和细胞存活率，而且在体内也没有引起急性免疫反应。
图3. 小鼠背毛生长实验。
为了阐明作用机制，研究者在小鼠治疗后20天的背部皮肤，评估了β-catenin，Erk1/2， pERK1/2 ，SFRP2，GAPDH的蛋白质含量(图4 A/B)。结果显示，与对照组和米诺地尔组相比，3D培养DP细胞组的β-catenin和p-Erk1/2表达上调，而SFRP2表达下调。WNT/β-catenin通路在促进头发生长中发挥重要作用。β-catenin是毛囊生长的关键调节因子。这些结果表明，3D培养DP细胞可能通过上调WNT通路中的β-catenin信号激活毛囊生长。作者还对SFRP2和β-catenin进行了免疫荧光染色（图4 C/E），进一步证实了在3D培养DP细胞中SFRP2的下调和β-catenin的上调。因此，3D细胞培养可能是一个提高DP细胞治疗的有效策略。
图4. 免疫印迹和免疫组织学分析
研究者认为以细胞为基础的治疗是实现毛囊新生的希望，但是，利用细胞成分作为治疗催化剂将会成为一种更方便的治疗产品，从而可以取代细胞，成为新的治疗手段。外泌体和分泌体都可能参与头发生长过程。此外，根据文献，miR-218-5-p可以靶向调节SFRP2，因此，上调miR-218-5p的外泌体可能是本研究的主要研究对象。
图5A所示，由于细胞旁分泌的影响，DP细胞不仅影响局部注射部位的毛发生长，还影响未处理部位毛囊周期的调节。DP细胞通过释放各种生长因子和外泌体来刺激毛囊细胞的生长。研究者分别对2D、3D培养的DP细胞外泌体和分泌组进行提取，外泌体做了电镜、粒径和WB鉴定分析（图5 B/C）。为了比较外泌体中的miRNA含量，研究者进行了miRNA阵列分析，发现3D培养的DP细胞表达的miR-218-5p显著高于2D培养（图5D）。图5E所示，bFGF可被细胞膜结合的FGFR接受并上调p-Erk1/2的表达，从而上调β-catenin的表达。已知TIMP2可以抑制基质金属蛋白酶2 (MMP2)的表达，这可能会阻碍DP细胞的迁移和增殖。然而，金属蛋白酶介导的毛囊调控机制尚不清楚，需要进一步研究。生长因子参与了头发生长周期的促进，而bFGF的机制之前也有文献证实。与2D培养DP细胞分泌组相比，3D培养的DP细胞中bFGF和TIMP2的水平大约增加了一倍。此外，与2D培养DP细胞的外泌体相比，3D培养DP细胞的外泌体中的miR-218-5p上调了25倍。因此，确定外泌体中的miR-218-5p在介导头发周期中作用是本研究的主要重点。
图5. 2D和3D培养DP细胞的分泌体研究
为了验证DP细胞衍生的外泌体对小鼠毛发再生的影响，研究者做了外泌体对背部毛发再生研究，图6 A/B所示，2D培养DP细胞的外泌体与米诺地尔的治疗效果无显著差异，而3D培养DP细胞的外泌体的治疗效果效果与细胞治疗相似。为了探究治疗后SFRP2和 β-catenin在皮肤中的表达变化，研究者在第15天收集了不同组的背侧皮肤样本。免疫染色证实（图6C），使用3D培养DP细胞外泌体的治疗组 β-catenin表达明显增加，SFRP2表达有所降低，所以3D培养DP细胞的外泌体下调了SFRP2和 并且上调β-catenin(图6 C/D)。
因为miR-218-5p可直接靶向SFRP2，所以研究者制备了miR-218-5p模拟物和抑制剂，进一步验证miR-218-5p的功能。研究者把miR- 218-5p与聚乙烯亚胺(PEI)溶液混合，构建miR- 218-5p囊泡模拟物，并与PEI/阴性对照、PEI/miR-218-5p抑制剂等试剂一起，皮下注入脱毛小鼠的背部皮肤(图6E)。通过靶向SFRP2，miR-218-5p模拟物促进了毛囊发育，而miR-218-5p抑制剂则抑制了毛囊生长。我们可以看到，与对照组和miR-218-5p抑制剂相比，miR-218-5p模拟物处理后的头发再生效果显著。
